近日，ACS Synthetic Biology发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队赵鑫锐研究员课题组的研究成果“Efficient biosynthesis of furanocoumarin intermediate marmesin by engineered Escherichia coli” (Hu, et al., ACS Synth. Biol., 2025, 14 (3), 954-966.)。江南大学胡宝东博士后为论文第一作者，江南大学赵鑫锐研究员与中国药科大学赵玉成教授为论文通讯作者；论文作者还包括周景文教授、李江华教授、陈坚教授、堵国成教授和钟芳教授。
呋喃香豆素是一类以苯骈α-吡喃酮为母核结构的芳香族天然产物，是我国传统药用植物如前胡、独活、白芷等的主要功能活性成分之一，具有抗肿瘤、抗凝血、抗菌等多种生物活性。目前，香豆素的需求量逐年增加，全球香豆素市场呈现出稳步增长的趋势，预计到2029年市场规模将达到13亿元。呋喃香豆素的生产方法主要包括化学合成法和植物提取法。化学合成法是以水杨醛、取代苯酚等为原材料通过一系列化学反应合成香豆素，但是该方法存在能耗成本高、安全性差、反应条件严苛、收率低等问题。植物提取法是以前胡、白芷等药材的根花为原料提取获得呋喃香豆素，然而前胡、白芷的根花中总香豆素含量极低(低于1.5%)，且存在提取纯化过程复杂、得率低、受环境因素影响较大等问题。因此，针对上述问题和持续增加的市场需求，亟需开发呋喃香豆素绿色、可持续高效生产的新方法。
异紫花前胡内酯是合成线性呋喃香豆素的关键中间体，具备多种生物活性，由简单香豆素伞形酮经异戊烯基转移酶以及异紫花前胡内酯合酶(P450酶)催化生成。目前，微生物合成简单香豆素伞形酮已经取得显著进展(Zhao, et al., J. Biol. Eng. 2019, 13 (1), 44.; Xie, et al., Metab. Eng. 2024, 86, 89-98.)，但异紫花前胡内酯的微生物合成面临许多限速问题：(1)缺乏高效的异戊烯基转移酶和异紫花前胡内酯合酶；(2) P450酶与还原酶适配性欠佳；(3)细胞内用于合成的异戊烯基供体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)供给不足，进而限制了微生物合成异紫花前胡内酯的效率。
针对这些问题，研究团队构建了高效合成异紫花前胡内酯的大肠杆菌底盘细胞(图1)。首先，系统筛选了不同来源的伞形酮6-异戊烯基转移酶，通过结合Western blotting分析、体外活性测试、N端截短改造及促溶标签融合，获得了前胡来源的高活性PpPT1(图2)。其次，针对目前已知的两种异紫花前胡内酯合酶(CYP76F112和PpDC)，通过N端截短改造、P450酶还原酶适配性优化重构了异紫花前胡内酯合酶CYP76F112和PpDC的高效催化体系(图3)。随后，通过组装MBP-PpPT1、PpDCΔ2−29 和SmCPRI453V构建了异紫花前胡内酯的生物合成途径，MAR-1菌株72小时合成异紫花前胡内酯6.65 mg/L，通过强化内源甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径提高胞内DMAPP的供给水平，工程菌株MAR-6摇瓶培养72小时合成异紫花前胡内酯提升至24.44 mg/L(图4)。进一步，通过异紫花前胡内酯合成途径模块化优化，工程菌株MAR-18摇瓶培养72小时合成异紫花前胡内酯提升至37.14 mg/L(图5)。在5L发酵罐进行了工程菌株MAR-18合成异紫花前胡内酯验证，88小时异紫花前胡内酯滴度达203.69 mg/L，底物伞形酮的摩尔转化率达81.4% (图6)，是目前报道利用微生物合成异紫花前胡内酯的最高合成水平。此研究为大肠杆菌高效合成呋喃香豆素(补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯等)提供了技术支撑。
上述研究工作得到了国家重点研发计划(2019YFA0906400)、国家轻工业技术与工程一流学科(LITE2018-08)、中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设项目”(2060302)、中央高校基本科研业务费专项资金资助(2632024TD04)和云南特色植物提取实验室开放课题(YKKF2023002)等项目的资助。
图1 工程大肠杆菌中呋喃香豆素生物合成途径
图2 筛选高效催化伞形酮合成7-去甲基软木花椒素的异戊烯基转移酶
图3 还原伴侣工程提高异紫花前胡内酯合酶的催化效率
图4 强化内源MEP途径增强DMAPP供给提高异紫花前胡内酯的合成
图5 模块化优化增强工程菌株MAR-18异紫花前胡内酯的合成
图6 工程菌株MAR-18发酵罐水平高效合成异紫花前胡内酯
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