近日，Angewandte Chemie International Edition在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队赵鑫锐研究员课题组的研究成果“Establishing an Efficient Electron Transfer System for P450 Enzyme OleP To Improve the Biosynthesis of Murideoxycholic Acid by Redox Partner Engineering（https://doi.org/10.1002/anie.202423209）。江南大学2021级博士生孙驰翔和厦门大学2023级博士研究生汪永超为论文第一作者，江南大学赵鑫锐研究员与厦门大学王斌举教授为论文通讯作者。
细胞色素P450酶是一类以血红素为辅基的单加氧酶。P450酶具有广泛的底物特异性，能够识别和作用于多种不同类型的底物，已被广泛应用于医药、环境保护和农业等领域。P450酶需要氧化还原伴侣进行电子转移，而氧化还原伴侣的电子传递效率是P450酶催化的关键限速步骤（图1）。由于缺乏系统的氧化还原伴侣工程策略，包括快速筛选合适的氧化还原伴侣、对氧化还原伴侣进行理性设计改造、对电子传递体系的机制解析等，因此很难有效地快速提高氧化还原伴侣的电子传递效率，从而提升P450酶的催化性能。
针对氧化还原伴侣电子传递效率低的问题，研究团队以P450酶OleP为研究对象，通过设计一种系统的氧化还原伴侣工程策略，可以高效地催化石胆酸制备鼠脱氧胆酸。本研究设计的高通量检测方法为检测羟基化胆汁酸类甾体药物提供了一种高效的方法，应用的氧化还原伴侣工程策略为P450酶构建其理想的氧化还原伴侣提供了一种可行的筛选策略。
具体内容如下：
（1）使用文献调研、数据库挖掘和序列比对等手段，建立了一个包含12对氧化还原伴侣的三组分氧化还原伴侣库。通过使用Alphafold2 Multimer对接铁氧还蛋白和P450酶并分析电子传递距离，快速虚拟筛选出5对比较合适的氧化还原伴侣。通过使用sfGFP感应器和全细胞催化实验，验证了氧化还原伴侣PetH/PetF最适配P450酶OleP，催化制备鼠脱氧胆酸的转化率达到32.5%（图2）。
（2）建立了快速检测石胆酸和鼠脱氧胆酸的高通量方法。文献表明使用强酸或强碱处理某些天然产物可以发生不同的化学反应，从而具有不同的特征吸收峰。基于此原理，本文设计了一种使用75%硫酸-乙醇的96微孔板检测方法，实现了对石胆酸和鼠脱氧胆酸的高通量检测（图3）。
（3）为了进一步提高PetH/PetF的电子传递效率，对铁氧还蛋白PetF进行设计改造。以高通量检测方法为基础，通过分析铁氧还蛋白PetF的结构信息，设计了一个包含48个氨基酸位点的突变体文库。应用FoldX软件进行突变体的设计和评估、sfGFP感应器筛选和全细胞催化验证，最佳突变体PetFF64D的转化率提升到80.9%（图4）。
（4）解析了P450酶OleP催化体系中的电子传递机制。通过蛋白-蛋白复合物的分子动力学模拟，表明与野生型OleP-PetF相比，突变体OleP-PetFF64D新增了一个静电相互作用位点（R105-F64D），从而将血红素到铁硫簇的平均距离由15.9 Å缩短至15.2 Å。由于电子传递距离的缩短，理论预测突变体OleP-PetFF64D的电子传递速率也提高了2.9倍，这一计算结果与提升的转化率吻合。此外，电子传递路径的预测也揭示了参与电子传递的关键氨基酸（图5）。
上述研究工作得到了国家重点研发计划（2019YFA0906400）、国家轻工业技术与工程一流学科（LITE2018-08）和江苏省研究生科研与实践创新计划项目（KYCX23_2486）等项目的资助，并荣获国际基因工程机器大赛（iGEM）生物制造赛道金奖。
图1：三组分P450酶中羟基化反应的催化过程
图2：筛选与P450酶OleP最适配的氧化还原伴侣
图3：构建高通量检测石胆酸和鼠脱氧胆酸的方法
图4：半理性设计改造铁氧还蛋白PetF
图5：P450酶OleP催化体系中的电子传递机制
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