近日，Journal of Agricultural and Food Chemistry在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队张娟教授课题组的研究成果“Fusion of Substrate-Binding Domains Enhances the Catalytic Capacity of Keratinases and Promotes Enzymatic Conversion of Feather Waste”（Ji et al., J. Agric. Food Chem., 2023, 71(30): 11579−11586.）。2022级博士生吉晓梅和博士后彭政为论文第一作者，张娟教授为通讯作者。
根据统计数据，2000年至2021年期间，全球禽肉年产量已从5900万吨增加到1.2亿吨。大规模禽肉消费的同时也产生了大量的羽毛等副产品。羽毛中角蛋白含量约占干重的85%，是潜在可用于食品和饲料工业的可持续蛋白质资源。由于其高度致密结构以及难降解的特性，开发高效的绿色转化技术是将角蛋白废弃物转化为饲用蛋白资源的关键。角蛋白酶是一类具有独特水解性质的蛋白酶，它们能将硬角蛋白废物降解为高附加值产品，如可溶性蛋白、氨基酸和生物活性肽等。然而，角蛋白酶的催化效率还受到多种因素的限制。与酶活力、稳定性同样重要的是酶与底物的结合能力，羽毛的高疏水性导致酶与底物结合困难。
针对这一关键问题，本研究团队从增强角蛋白酶与底物的结合能力展开研究。许多天然的聚合物水解酶，如纤维素酶和几丁质酶，可以通过底物结合结构域与底物预结合，以增加催化结构域与底物之间碰撞的机会，从而提高其水解效率。为此，本研究拟通过在角蛋白酶的C端融合不同来源的底物结合功能域，经过不同长度、类型的连接肽筛选，构建羽毛水解活性提高的角蛋白酶。旨在提高角蛋白酶与底物的结合能力，增大羽毛表面的酶浓度，以促进角蛋白酶对羽毛的水解效率。
在这项工作中，研究人员首先在Bacillus subtilis WB600中高效表达了来自Bacillus licheniformis的角蛋白酶基因，然后通过连接肽将底物结合域融合到角蛋白酶的C端。研究人员筛选了不同来源的底物结合域和不同长度、性质的连接肽。通过羽毛水解效率的验证，融合酶KerZ1/CBM-L8为最佳底物结合域和连接肽的组合。其羽毛水解效率与原始酶KerZ1相比提高了2.71倍，为7.8 × 10−8 g/U。kcat值比原始酶KerZ1高179%，这意味着更高的催化效率，Km和结合常数（K）值较低，这表明融合酶与角蛋白的结合亲和力较高。此外，使用等温滴定量热法测定融合酶与角蛋白底物的结合位点的数（N）是KerZ1的24.1倍，进一步证明了融合酶与底物的结合能力的提高。因此，使用融合角蛋白酶将显著提高羽毛废料的回收率。
上述工作得到了国家重点研发计划项目（2022YFD2101402和2021YFC2104000）、国家自然科学基金项目（22208125）、江苏省自然科学基金项目（BK20221084）、江苏省重点研发计划项目（BE2021624）和江苏省卓越博士后计划项目（2022ZB497）的支持。
图1 融合酶KerZ1/CBM连接肽的筛选
图2 角蛋白酶与角蛋白底物结合能力的测定
（编辑：潘梦妍）
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