近日，ACS Synthetic Biology在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队张娟教授课题组的研究成果“Reducing cellular autolysis of Bacillus subtilis to improve keratinase production”（Chen et al., ACS Synth. Biol., 2023, 12(10): 3106-3133.）。2021级硕士陈希文为论文第一作者，张娟教授和博士后彭政为通讯作者。
枯草芽孢杆菌由于其遗传背景清晰、生长速度快、适应能力强、蛋白分泌能力强、无细胞毒素产生以及适合高密度发酵等优点，被广泛应用于外源蛋白的生产。然而，随着发酵时间的延长，在发酵后期，枯草芽孢杆菌的细胞自溶导致生物量降低，进而影响了菌株生产蛋白的能力。虽然发酵过程中环境胁迫和代谢产物的积累会造成细胞裂解，但是细胞自身所携带自溶基因的表达也是细胞裂解的关键因素。因此，通过缺失枯草芽孢杆菌细胞自溶相关基因，降低细胞自溶程度可能会是提高异源蛋白在枯草芽孢杆菌中产量的有效策略。
在这项工作中，研究人员以前期构建的可以表达角蛋白酶的工程菌株Bacillus subtilis WB600-ker为出发菌株，在不同的发酵阶段，使用qRT-PCR技术对营养生长期作用的肽聚糖水解酶基因lytC、lytD、lytE、lytF、lytG、lytH、cwlC、cwlS及其相关转录调节因子sigD；原噬菌体相关肽聚糖水解酶基因xlyA、xpf、cwlA、pcfA；以及自食相关基因skfA、spbC的转录水平进行监测。结果显示，在发酵中后期这些基因的表达都存在不同程度上调，这与枯草芽孢杆菌细胞自溶表型一致。其中，基因lytC、cwlC、sigD、xpf、pcfA、skfA、spbC上调幅度较为显著，因此认为这是导致枯草芽孢杆菌细胞自溶的关键基因。研究人员以这7个基因作为敲除靶点，共构建127株自溶基因缺失菌株。其中xpf、lytC、pcfA和cwlC的多缺陷菌株B. subtilis BS∆XLPC-ker的生物量较出发菌株提高了57%。接着，通过细胞染色、绿色荧光蛋白成像和细胞外核酸泄漏实验证实了这一结果。最终在5 L发酵罐中表达测试目标角蛋白酶的活力是对照的1.46倍。另外，在B. subtilis BS∆XLPC中也分别将纳豆激酶和枯草蛋白酶E的活性提高1.50倍和1.43倍，进一步证实了策略的普适性。
上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2022YFD2101402）、国家自然科学基金项目（22208125）、江苏省自然科学基金项目（BK20221084）、江苏省卓越博士后计划项目（2022ZB497）的资助。
图1 自溶基因敲除菌株表达角蛋白酶酶活性测定结果
图2 菌株B. subtilis BS∆XLPC-ker细胞特性测试
（编辑：潘梦妍）
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