通过改造高柔性区域显著提高黑曲霉木聚糖酶的热稳定性

近日，Journalof Agricultural and Food Chemistry在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队刘松副教授课题组的研究成果“Significantly enhanced thermostability of Aspergillus niger xylanase by modifying its highly flexible regions”（Li et al., J. Agric. Food Chem., 2022, 70 (15), 4620-4630）。2019级博士生李阳阳为论文第一作者，刘松副教授为通讯作者，论文作者还包括堵国成教授、李江华教授和周景文教授等。

木聚糖是一种多聚合度的杂多糖，含有β-1,4-连接的木糖主链，是植物细胞壁中半纤维素的主要成分。木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是最重要的木聚糖水解酶之一，可以催化木聚糖中β-1,4-糖苷键的水解，产生木二糖、木三糖和低聚木糖，其中大多数属于GH10家族和GH11家族。与其他GH家族相比，GH11木聚糖酶拥有广泛的pH耐受性，更高的催化活性和底物特异性。目前，GH11木聚糖酶已被成功应用于功能性食品、药品，以及动物饲料等的生产。在这些应用中木聚糖酶需要在50°C以上的环境中保持数十小时的活性。然而，大多数GH11木聚糖酶属于中温酶，在50°C的半衰期仅为十几分钟。因此，提高GH11木聚糖酶的热稳定性是首要任务。

针对上述问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队对通过系统地改造四个高柔性区域（HFRs），显著提高了黑曲霉AG11来源的耐酸型GH11木聚糖酶（xynA）的热稳定性。首先，通过迭代饱和突变对HFR I（残基92-100）和HFR II（残基121-130）进行改造，分别得到热稳定突变体G92F/G97S/G100K和T121V/A124P/I126V/T129L/A130N。其次，HFR III中的N端（残基1-37）和C端（残基179-188）分别用来自嗜热的EvXyn11^TS和Nesterenkonia xinjiangensis来源的木聚糖酶相应序列替换。再次，通过定点突变（A55N/D57S/S61N）将N-糖基化引入HFR IV（残基50-70）并在A. niger AG11中表达。最后，将上述正向突变位点组合得到变体xynAm1。与野生型xynA相比，xynAm1在50℃下的半衰期和比酶活分别提高了137.6倍和1.3倍。此外，xynAm1在80℃和90℃的半衰期分别达到156.8 min和 65.4 min，是目前报道的GH11木聚糖酶中的最高水平。基于显著提升的热稳定性，xynAm1将有望成为工业化应用中最具竞争力的木聚糖酶品种之一。

上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2021YFC2101400）和国家自然科学基金面上项目（32071474）的资助。

图1 xynA的高柔性区域

图2 HFR I和HFR II内的迭代饱和突变对xynA的热稳定性和催化活性的影响

图3 HFR III内的序列替换对xynA的热稳定性和催化活性的影响

图4 HFR IV内的N-糖基化修饰对xynA的热稳定性和催化活性的影响

图5 xynA和xynAm1的动力学模拟

图6 xynA和xynAm1的结构比较

原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/Zg5y1ABrRD6odcvIXerRsw

（编辑：潘梦妍）