近日，Nucleic Acids Research发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队刘延峰研究员课题组的研究成果“An evolved, orthogonal ssDNA generator for targeted hypermutation of multiple genomic loci”（Chu et al., Nucleic Acids Res., 2025, 53(3):gkaf051）。刘延峰研究员为论文通讯作者，22级博士研究生储未然为第一作者。
基因组原位靶向连续进化是实现目的序列的原位连续进化关键技术，能够显著提高细胞工厂的底物利用率、产物合成效率等特性，是合成生物学研究有力工具。目前基因组原位靶向连续进化主要存在以下问题：(1) 依靠逆转录酶产生单链DNA文库并与同源序列重组实现突变，此策略受限于逆转录过程无法合成长单链DNA，无法实现长基因片段的连续进化；(2) 使用易错的DNA聚合酶或脱氨酶与Cas9切口酶（nCas9）融合并靶向目的序列实现突变，难以进化长基因片段且存在脱靶风险。因此，开发新型单一元件介导的，基因组原位靶向连续进化工具有重要意义。
针对以上问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队研究人员提出利用T7 RNA聚合酶特异性识别T7启动子的性质，通过定向进化以及理性设计使T7 RNA聚合酶突变体获得合成单链DNA文库的能力，并于基因组上的同源序列重组，实现靶向高效突变，达到连续进化的目的。首先针对T7 RNA聚合酶不同的结构域以及热点区域，设计定向进化文库，获得了可以达到1%重组效率的T7 RNA聚合酶突变体TM10；随后根据T7 RNA聚合酶在延伸过程中的底物选择机制，理性设计了错配T7 RNA聚合酶突变体EM8，使其突变率达到6.5*10-7（s.p.b），为基因组突变率的2800倍，该工具命名为T7ACE（T7 RNAP mutant-assistedcontinuous evolution）；研究人员进一步利用T7ACE对大肠杆菌基因组上的四环素外排泵基因（tetK）以及木糖代谢的4个关键基因的启动子、RBS以及N-端编码序列进行连续进化，成功获得抗性改变和木糖利用效率提高的菌株，证明T7ACE在长基因片段以及多基因多位点连续进化的高效性；最后，研究人员拓展了T7ACE模式真核微生物酿酒酵母中的应用，证明了T7ACE连续进化工具的通用性高、普适性强。
上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2020YFA0908300）、国家优秀青年科学基金项目（32222069）等项目的资助。
图1 筛选可以合成ssDNA并在体内完成高效重组的T7 RNA聚合酶突变体
图2 连续进化四环素外排泵基因（tktK）以及木糖利用率
（编辑：潘梦妍）
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