酿酒酵母中逐步优化辣根过氧化物酶表达系统以实现其高效分泌合成

近日，Journal of Agricultural and Food Chemistry在线发表了江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队赵鑫锐副研究员课题组的研究成果“Stepwise optimization of inducible expression system for the functional secretion of horseradish peroxidase inSaccharomyces cerevisiae” (Zhao, et al.J. Agric. Food Chem.2023, 71, 9, 4059-4068)。江南大学赵鑫锐副研究员和2022级博士生于海波为论文共同第一作者，赵鑫锐副研究员为论文通讯作者，论文作者还包括20级本科生梁庆锋，周景文教授，李江华教授，堵国成教授和陈坚教授。

辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)是一类植物来源的以血红素作为辅基的分泌型糖蛋白。由于具有优异的过氧化物酶活性，HRP被广泛应用于医疗诊断、生物催化、生化分析和生物修复领域。由于其能够生成自由基交联多聚物和抑菌的特性，在食品领域中被用于食品多聚物的合成或蛋白交联。近年来，还被应用于制造生物相容性水凝胶作为组织工程中的细胞生长支架或是用于制造细胞培养肉需要的可食用微型支架。目前，HRP的生产主要通过植物提取获得，由于植物种植需要大面积的土地和较长的生长时间，加之破碎提取程序的复杂与耗能，还有同工酶所引起的生化特性不均一等问题。因此，利用微生物重组生产HRP提供了另一种选择，但现有的重组生产方法各有优劣。大肠杆菌具有最高的HRP产量，但无法实现糖基化修饰，且需要额外的包涵体复性步骤，所得HRP稳定性仅为真核微生物分泌生产的一半。真核宿主中，酿酒酵母、球隐酵母与毕赤酵母均已被报导可用于HRP的可溶功能性生产。其中，酿酒酵母具有更高的食品安全应用价值，但其较低的产量(25-41 U/L)严重阻碍了应用。

针对此问题，江南大学食品合成生物学与生物制造研究室研究人员实现了HRP在酿酒酵母中的高效分泌表达，相比前人报导提高330倍。由于HRP具有复杂的结构与翻译后修饰，极有可能引起细胞应激导致生产过程中的生长抑制。因此，首先利用组成型(pTEF1和pTDH3)和诱导型启动子(pGal1和pGal7)控制HRP的表达，考察菌株的生长情况与HRP产量(图1)。结果发现采用组成型表达的方式会引起严重的生长抑制和较低的HRP产量(最高25 U/L)，而诱导型表达可合成1284 U/L的HRP，是组成型表达的47倍。接着为了维持最优诱导启动子pGal1的调控特性，保留了其上游顺式转录因子结合区域(upstream cis-regulatory module, CRM)，通过筛选不同强度的核心启动子区域(core promoter region, CPS)，对诱导表达的泄露水平与表达强度进行粗调(图2A-C)，同时敲除阻遏因子基因GAL80以进一步提高启动子活性(图2D和E)。另一方面，相比强启动子，终止子更容易影响弱启动子的表达效果。基于这种认识，终止子将更容易影响关闭状态下诱导启动子的泄露情况。因此，通过筛选不同强度的终止子实现了对诱导表达的泄露水平与表达强度的细调(图3)。在针对表达系统进行了三步优化后(图4)，HRP产量达到了5093 U/L，相比初始的组成型表达提高了203倍。