近日，Microbial Cell Factories在线发表了江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队周景文教授课题组的研究成果“Engineering Saccharomyces cerevisiae for the production of dihydroquercetin from naringenin” (Yu, et al. 2022,21 (1): 213)。江南大学余世琴为论文第一作者，周景文教授为论文通讯作者，论文作者还包括19级硕士李明佳、博士后高松。
二氢槲皮素(DHQ)，俗称黄杉素，是一种具有生物活性的类黄酮，存在于植物中，如牛奶蓟、红洋葱和红棕榈，以及多种商业药用制剂。二氢槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗癌等生物活性，是一种重要的膳食补充剂和功能性食品，在神经退行性疾病、高血压、病毒感染等疾病的预防和治疗方面具有良好的应用前景。研究表明，二氢槲皮素的抗氧化能力超过了常见的抗氧化剂，如生育酚和抗坏血酸，这是一种强大的自由基中和化合物，能保护身体组织免受有害的自由基。伴随着日益增长的市场需求，二氢槲皮素传统植物提取法由于原料限制、提取工艺复杂、得率低等问题，迫切需求寻求更为经济、高效和绿色的生产方式。柚皮素(NAR)是一种可通过果汁生产过程中废弃的果皮而大量获取，价格相对低廉的原料。通过改造微生物表达两个关键羟化酶及细胞色素P450还原酶，利用改造的全细胞催化底物柚皮素可实现二氢槲皮素的生物合成。其全细胞催化目前主要存在几个问题：(1) 终产物得率较低；(2) 存在大量中间产物，转化率低。
针对此问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队研究人员采用生物法合成，通过改造酿酒酵母实现涉及反应过程关键酶的活性表达与平衡，从而促进二氢槲皮素的生物合成。研究人员首先通过对来自不同植物的类黄酮3′-羟化酶(F3′H)及其氧化还原伴侣的进行组合表达，其中来自于水飞蓟SmF3′H与来自于酿酒酵母的ScCPR在深孔板发酵获得了最佳的产量，可达435.7 mg/L 圣草酚(Eriodietyol)。通过生物信息学分析预测了潜在该酶潜在的泛素化修饰位点，并通过点突变延长表达类黄酮3′-羟化酶(F3′H)半衰期的方式，进一步提高了产量，最佳突变F3′H_K290R在酿酒酵母最终获得12.8%的产量提升。研究人员通过筛选二氢槲皮素生产中第二个关键酶黄烷酮3 -双加氧酶(F3H)以促进其合成。在上述菌株基础上，其中来自于甜橙的黄烷酮3-双加氧酶(F3H)的表达，实现了303.0 mg/L二氢槲皮素产量。最后通过对表达黄烷酮3-双加氧酶(F3H)的启动子进行替换，发现强启动子反而降低二氢槲皮素的生物合成量，而时空错开的表达方式，通过诱导型Gal 启动子更有利于两个羟化酶的表达，通过上述几种策略最终在深孔板实现从1 g/L的NAR中积累381.2 mg/L的DHQ，产率为67.0 mg/gCDW，转化率为0.34 mol DHQ/mol NAR。尽管研究并未在发酵罐进行优化放大，本研究为从相对低廉的底物生产高价值二氢槲皮素提供了有效的生物合成策略。
上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2021YFC210700）、江苏省双创博士计划(JSSCBS20210847)项目的资助。
图1 优化类黄酮3′-羟化酶与其细胞色素P450还原酶的表达
图2 通过突变潜在泛素化位点强化类黄酮3′-羟化酶的稳定性
图3 优化黄烷酮3-双加氧酶表达以增强二氢槲皮素的合成
图4 启动子优化平衡类黄酮3′-羟化酶和黄烷酮3-双加氧酶的表达
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/AS8-0whaVjHztdWsPdTMNw
（编辑：潘梦妍）
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