近日，Metabolic Engineering在线发表了江南大学未来食品科学中心和粮食发酵工艺与技术国家工程研究室陈坚院士团队周景文教授课题组的研究成果“Development of a growth coupled and multi-layered dynamic regulation network balancing malonyl-CoA node to enhance (2S)-naringenin biosynthesis in Escherichia coli”（Zhou et al., 2021, Metab. Eng., 67:41-52）。2014级博士毕业生周胜虎副研究员为论文第一作者，周景文教授和邓禹教授为通讯作者。
丙二酰-CoA在众多化合物的生物合成过程中扮演着碳链延伸单元的重要角色。例如柚皮素等黄酮类化合物的合成需要经过查耳酮合成酶(CHS)的3步连续碳链延伸反应，消耗3分子丙二酰-CoA。而胞内丙二酰-CoA含量极少，且不同生长阶段不同生长环境下含量有数量级的波动，这限制了柚皮素的生物合成。此外，丙二酰-CoA也是脂肪酸合成的重要前体，脂肪酸主要用于细胞膜形成，过多消耗丙二酰-CoA会抑制细胞生长。而丙二酰-CoA在胞内过多积累会引起蛋白质组的酰基化水平升高，进而引起一系列的生理问题。因此，如何协调细胞生长、丙二酰-CoA积累和柚皮素合成是目前面临的重要难题。脂肪酸合成途径中与丙二酰-CoA相关的关键基因众多，同时也要考虑到细胞生长中后期丙二酰-CoA合成来源极大降低，需要在细胞不同生长时期对多个基因进行不同方式和不同水平的动态调控，这显著增加了动态调控网络设计的难度。
从发酵过程的微观层面考虑，发现发酵过程的任意时期都含有大量高产、低产、年轻和年老的细胞。发酵系统是一个异常混杂的体系，这是细胞代谢异质性所决定的。因此，设计一个可以实时监测单细胞生长代谢状态的动态调控网络，从单细胞水平上进行动态调控，将显著降低代谢异质性的影响，极大促进发酵效率。
针对丙二酰-CoA供应不足引起的细胞生长与产物合成不协调等挑战，本研究团队基于柚皮素和对香豆酸生物传感器，设计了3层动态调控网络，对柚皮素合成相关的10余个基因进行了协同动态调控，实现了在任何生长时期的单细胞水平上对大肠杆菌进行精准动态调控的目标。所构建生物传感器第一层为组成型表达的柚皮素合成途径(TAL、4CL、CHS和CHI)；第二层为柚皮素响应的动态调控网络，可以响应柚皮素浓度而逐渐抑制酰基载体蛋白(ACP)的活性，与第一层组合获得一个与生长耦合的动态放大系统；第三层为对香豆酸响应的动态调控网络，可以响应对香豆酸浓度从而强化丙二酰-CoA的合成途径。最后通过Biosensor-FACS定向进化策略对三层动态调控网络进行了系统优化，显著提高了柚皮素的产量，在250 mL摇瓶中产量达到523.7±51.8 mg/L，是未使用动态调控系统菌株的8.7倍，且细胞生长提高了20%。
上述研究工作得到了国家重点研发项目（2019YFA0904800）、国家自然科学基金（21822806、31900066、21877053和31770097）、中央高校基本科研（JUSRP12056、JUSRP51705A）、国家轻工技术与工程一流学科自主课题（LITE2018-24）等项目的资助。
图1 生长偶联的多层动态调控网络合成柚皮素
图2 柚皮素和对香豆酸响应的生物传感器设计
图3 第一层和第二层动态调控网络组合功能验证
图4 第一、二、三层动态调控网络组合功能验证
图5 基于生物传感器和流式细胞仪的定向进化策略优化动态调控网络
（原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/Idd8S1dMMcPeOSudjzU3RQ）
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