近日，Nature communications在线发表了江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队刘延峰研究员课题组的研究成果Titrating bacterial growth and chemical biosynthesis for efficient N-acetylglucosamineand N-acetylneuraminic acid bioproduction。江南大学2018级博士生田荣臻为论文第一作者，陈坚教授和刘延峰研究员为通讯作者，论文作者还包括刘龙教授、李江华教授和堵国成教授。
目标化学品的生物合成往往与微生物细胞生长竞争资源，如何平衡细胞的生长与产物合成是构建高效代谢工程菌株的核心问题之一。针对此问题，目前已经发展出多种代谢工程策略。例如，基于遗传回路的细胞生长与生物合成解耦合、基于途径重构的细胞生长与生物合成耦合以及平行代谢途径工程。这些策略能在一定程度上实现细胞生长与产物合成的重分配，但是针对不同产物需要大量“试错性”基因回路设计，同时途径重构基因回路调控过程会受到胞内复杂代谢环境的潜在干扰。因此，亟需设计一种普适性高且鲁棒性好的细胞生长和生物合成平衡策略。
针对此问题，江南大学生物工程学院生物系统与生物加工工程研究室研究人员在大肠杆菌（Escherichiacoli）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中开发了基于密码子拓展的细胞生长与产物合成平衡策略，并成功应用于大肠杆菌N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）生产与枯草芽孢杆菌N-乙酰神经氨酸（燕窝酸，NeuAc）生产中。基于密码子拓展的正交翻译系统的探索与发展为合成生物学提供了一种新的工具。将正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对引入宿主中并在靶基因中引入非常规密码子，可以在蛋白翻译中掺入特定的非天然氨基酸（ncAA），从而在实现精确调控靶蛋白翻译水平，同时避免胞内天然代谢产物的干扰。基于此，研究人员首先在基因组重编码的革兰氏阴性模式细菌大肠杆菌（基因组编码序列中的321个TAG终止密码子全部编辑为TAA）中进行了测试。在大肠杆菌中对于ncAA利用工具pEVOL的表征结果显示，添加不同浓度ncAA（pAcF）能激活约9.01倍的基因表达水平。同时通过代谢工程改造，研究人员获得了一株产GlcNAc的基因组重编码大肠杆菌。但是，发酵过程中乙酸的积累严重损害了细胞生长以及目标化合物的合成。基于乙酸合成、产物抑制、底物消耗、细胞生长及产物合成动力学模型的模拟结果显示，控制糖酵解通量在一定范围内可以实现细胞生长和目标化合物合成之间的竞争的平衡，并可以避免副产物乙酸的积累。因此，研究人员将ncAA利用系统用于滴定pfkA基因的表达水平，以实现糖酵解途径和GlcNAc生物合成途径碳通量的精确控制。经过测试，菌株生长情况与GlcNAc合成均得到了改善：菌株OD600从12.2提升至25.2，提高1.06倍。乙酸水平降低83.75％（至0.90g/L）。GlcNAc产量提高4.54倍（12.77g/L），达到理论得率的88.52％。
为了进一步验证该策略对细菌的通用性，研究人员进一步在基因组未重编码的革兰氏阳性模式细菌枯草芽孢杆菌中进行了测试。由于目前缺乏枯草芽孢杆菌中相应的ncAA利用工具，因此，研究人员首先通过结合理性设计与非理性筛选，构建了枯草芽孢杆菌单mutRNA拷贝的ncAA（OMeY）高效利用系统pBUA，实现了约80倍的基因表达水平激活。然后，通过SIFT算法预测合理的必需基因插入位点并进行TAG终止密码子的插入，成功构建了OMeY依赖的枯草芽孢杆菌，并进一步实现了菌株比生长速率的精准控制。将其应用于燕窝酸生产工程菌株后，燕窝酸产量提高2.34倍（至4.72g/L）。为了扩展应用规模，研究人员将燕窝酸合成关键基因age与neuB整合至pBUA，实现了单质粒菌株的稳定发酵。在3L发酵罐中，燕窝酸产量从3.3 g/L提升至9.7g/L，提高至3.0倍，副产物乙偶姻降低56.4%。此外，OMeY依赖型枯草芽孢杆菌的的构建实现了重组枯草芽孢杆菌的“生物封存”(避免重组菌逃逸至自然环境中繁殖)，工程菌株逃逸率(1/1010)远低于国际要求(1/108)。此研究为生长与代谢精准可控高版本底盘细胞创建提供了新策略。
上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2018YFA0900300）、国家自然科学基金（31972854）、中央高校基本科研专项资金（JUSRP22036）、“轻工技术与工程”国家一流学科项目（LITE2018-16）和江苏省研究生科研创新计划（JNKY19_015）的资助。
图1 基于遗传密码扩展平衡细胞生长和产物合成
图2 在基因组重编码的大肠杆菌D321AM中实现基于非天然氨基酸（ncAA）利用工具的途径调控
图3 枯草芽孢杆菌非天然氨基酸利用工具的构建与优化
图4 不同O-甲基-L-酪氨酸（OMeY）浓度对OMeY依赖型工程枯草芽孢杆菌生长的影响
图5 平衡细胞生长与燕窝酸（NeuAc）生物合成
图6 O-甲基-L-酪氨酸（OMeY）依赖型工程枯草芽孢杆菌逃逸率的测定
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