Advanced Science、Bioresource Technology|陈坚院士团队周景文教授课题组研究成果：维生素C一步发酵法合成工艺开发

近期，江南大学未来食品科学中心陈坚院士团队周景文教授课题组在维生素C的一步合成工艺开发方面获得重要研究进展——研究团队为加快维生素C一步合成工艺的研究，从不同角度出发在不同合成途径方面均获得了突破性进展。相关研究成功为维生素C单菌一步发酵工艺的实现提供了元件和方向，将大幅度降低维生素C生产过程中的能耗，对维生素C工业生产技术的更新换代有着重要推动。相关研究分别发表于Advanced Science (Li et al., Adv. Sci., 2023, 10: 2301955, 博士后李冬为论文第一作者，周景文教授为论文通讯作者)和Bioresource Technology (Li et al., Bioresour. Technol., 2023, 384: 129316, 2019级博士生李光为论文第一作者，周景文教授为论文通讯作者)。

维生素C是人体必需的维生素之一，其超强的抗氧化能力、自由基清除能力和其它相关生理功能使其被广泛应用于医药、食品、化妆品和饲料等各个领域。维生素C每年需求量在15万吨以上，超过其它所有维生素类产品的总和，且还在以每年10%左右的增速持续增长。过于活跃的化学性质导致维生素C无法长期稳定存在于复杂的液体环境中，因此，工业上都是以合成其前体物质2-酮基-L-古龙酸来实现维生素C的大规模生产。

目前2-酮基-L-古龙酸的主要生产方式为三菌两步法，首先通过高压加氢的方式将葡萄糖转化为山梨醇，再通过氧化葡萄糖酸杆菌将山梨醇转化为山梨糖，最后通过普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合发酵的方式将山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。也可以直接以葡萄糖为底物，首先通过氧化葡萄糖酸杆菌将葡萄糖转化为2.5-二酮基-D-葡萄糖酸，再使用谷氨酸棒状杆菌将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为2-酮基-L-古龙酸，但该方法操作难度较大，未实现工业化生产(图1)。三菌两步法虽然转化率高，但高能耗带来的问题始终是困扰企业的主要难题，如何通过一种细菌一步发酵直接实现2-酮基-L古龙酸的生产一直是困扰维生素C产业的关键问题。

陈坚院士团队周景文课题组以氧化葡萄糖酸杆菌为底盘菌株，从山梨醇和葡萄糖两条合成途径同时着手，开发出了维生素C单菌一步发酵工艺。研究团队通过外源引入山梨酮脱氢酶与山梨糖脱氢酶构建出可以直接利用山梨醇一步发酵合成2-酮基-L-古龙酸的工程菌株，168小时可以产2-酮基-L-古龙酸68.1 g/L。并利用结构生物学解析了山梨醇途径中的关键限速酶——山梨酮脱氢酶，解析了山梨酮脱氢酶的催化机制，通过底物通道工程提升了山梨酮脱氢酶的活性。此外，还利用拉伸分子动力学和量子力学等手段对实验结果进行了计算机模拟(图2)。这一研究成果可以为一步发酵维生素C提供了优良的酶元件。

为了更快的解决维生素C一步合成问题，课题组研究人员从不同角度出发同时研究了以葡萄糖为底物的单菌一步发酵过程。通过对氧化葡萄糖酸杆菌ATCC9937的基因组信息进行分析。挖掘出了一个新型的可以将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为2-酮基-L-古龙酸的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶，并通过去除副反应，增加细菌内部2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶的量，引入2,5-二酮基-D-葡萄糖酸向细胞内部的转运途径等手段开发出了可以高效利用葡萄糖经过一步发酵直接合成2-酮基-L-古龙酸的新型维生素C合成工艺(图3)。最后通过对生产过程的工艺进行优化，在5 L水平的发酵罐内62小时左右获得了约30.6 g/L的2-酮基-L-古龙酸产量，使葡萄糖的转化率达到了约40%。